近年来，国内外对石油及兵产品的微生物降解研究常见报道，却鲜见机油废水微生物降解方面的研究。本试验目的是通过常规微生物驯化方法，以市售机油为唯一碳源，从油污土壤中分离筛选出机油高效降解菌株，并对其生长条件及降解特性进行研究，以期进一步应用于含油污水的治理。
1 材料与方法
1．1 土壤样品
某石油库贮油罐附近的石油污染土壤，取样3份，按含油量由多至少编为1＃，2＃，3＃。
1．2 培养基
本试验选取两种无机基础培养基，（用蒸馏水配制并高压蒸气灭菌），编号分别为1＃，2＃，组成如下：
1＃基础培养基：p（KH2PO4）＝0.5g／L，ρ（K2HPO4）＝0.5g／L，P（MgSO47H2O）=0.2g／L，ρ（NaCl）=0.2g／L，p（CaCl2）＝0.1g／L，ρ（NH4NO3）＝1.0g／L，MnSO4痕量，FeCl3痕量。
2＃基础培养基：p（NaNO3）=2.0g／L，ρ（KH2O4）＝0．2g／L，ρ（MgSO4.7H2O）＝0.2g／L，ρ（酵母浸膏）＝1.0g／L．
含油培养基是向上述无机基础培养基中加入适量机油。固体培养基中加入质量分数为0．2％的琼脂。
1．3 优势菌筛分试验
1．3．1 选择富集培养
称取土样各10g，加入到500mL1＃含油培养基（含机油4mL）中，调pH值7.0，通气恒温30℃培养48h后，分别移取上述培养液5mL于45mL1＃，2＃含油培养基（含机油2mL）中，恒温30℃振荡培养。
1.3.2 平板分离
制作1＃，2＃固体含油培养基平板苦干，用接种环蘸取振荡培养较好的菌液在相应平板划线，恒温30℃培养48h后平板划线分离，重复数次。选择生长状况良好的菌株进行平板扩大培养。
1．4 生长条件正交试验
在保证供氧和氮、磷营养前提下，选择温度。油的质量浓度（以mg／L计）和pH值作为本次实验的三个因素进行三水平实验，方案见表1、表2。将平板培养48h的菌体刮下，5000r／min离心5min，分离得到湿菌体。向方案中每个样品加入0.5g湿菌体，培养60h后测定样品中油的质量浓度。
表1 ZL1菌株正交试验方案及试验结果
分组号
因素
测定结果ρ（油）/（mg.L-1)
降解测量ρ（油）/（mg.L-1)
温度/
ρ（油）/（mg.L-1)
pH值
1
25
424
5.0
192
232
2
25
680
7.0
416
264
3
25
824
9.0
630
194
4
30
424
7.0
220
204
5
30
680
9.0
507
173
6
30
824
5.0
654
170
7
35
424
9.0
297
127
8
35
680
5.0
569
111
9
35
824
7.0
755
69
K1
690
563
513
K2
547
548
537
K3
307
433
494
K1
230
188
171
K2
182
183
179
K3
102
144
165
R
128
44
14
表2 ZL2菌株正交试验方案及试验结果
分组号
因素
测定结果ρ（油）/（mg.L-1)
降解测量ρ（油）/（mg.L-1)
温度/
ρ（油）/（mg.L-1)
pH值
1
25
368
4.0
69
299
2
25
574
6.0
267
307
3
25
767
8.0
479
288
4
30
368
6.0
354
314
5
30
574
8.0
296
278
6
30
767
4.0
462
305
7
35
368
8.0
142
226
8
35
574
4.0
342
232
9
35
767
6.0
548
219
K1
824
769
766
K2
897
817
840
K3
677
812
792
K1
275
256
255
K2
299
272
280
K3
226
271
264
R
73
16
25
1.5 降解能力试验
配制机油质量浓度为270mg／L的含油培养基1L，投入小型间歇反应器中，加入离心分离得到的湿菌体5g，通气恒温30℃培养，间隔12h取样测定其含油量。
1．6 测试方法
用紫外介光光度法测定。
2 结果分析
2．1 优势菌筛分试验
富集培养过程中，1＃土样的培养液出现的泡沫较多，乳化现象明显，菌液也较为粘稠，分离出较多的菌株，说明土壤中的石油烃能刺激石油降解菌的生长。经过选择富集培养、平板分离出4株以机油为唯一碳源的菌株，编号为ZL1，ZL2，ZL3，ZL4，性状见表3。进一步培养后筛选出降解性能较好的ZL1（1＃培养基）和ZL2（2＃培养基）进行正交试验和连续培养试验。
表3 4株机油降解菌形态特征
形态特征
ZL1
ZL2
ZL3
ZL4
菌落颜色
粉红
淡黄
淡黄
粉红
菌落形态
不透明，微隆起，全缘，
半透明，圆形
半透明，圆形，隆起，
不透明，米粒状突起，
光滑，有光泽
光滑，较干燥
光滑，有光泽
较湿润
菌体形态
短杆
球形
杆状
丝状
菌体大小/μm
（0.3-0.8)×(0.6-1.0）
Φ0.3
（0.5-0.8)×(1.3-5.0)
0.2×(6-60)
革兰氏染色
G
G
G
G
初步鉴定
黄杆菌属
微球菌属
假单胞菌属
酵母菌属
2．2 生长条件正交试验
ZL1，ZL2菌株按设定的正交试验方案进行试验，测定其剩余含油量，以降解油量作为考察指标，计算结果见表2、表3。分析极差值R可以看出：ZL1菌的R温度为128，ZL2菌的R温度为73，均为最大极差值，说明温度是影响降解效果的主要因素。25℃ZL1菌降解机油能力较强；油质量浓度越低降解效果越好；pH值为7时，降解效果最好，说明ZL1菌适于在中性条件下生长。30℃ZL2菌降解机油能力较强；机油的质量浓度在368-767mg／L范围内对降解效果影响不大，以ρ（油）=574mg／L时降解效果最明显，还应进一步扩大试验的油含量范围以确定油含量对ZL2菌降解能力的影响；pH值在4－8范围内对降解效果的影响也不显著，其中PH值为6时降解效果最好，说明ZL2菌较适于在中性偏酸条件下生长。
2.3 降解能力试验
向1L油质量浓度为270mg／L培养液中投加5g湿菌体进行间歇培养，考察ZLI，ZLZ菌的降解能力，结果见图1。由含油量与培养时间关系曲线可以看出：ZL1，ZL2菌被加人含油培养基后很快适应环境，随着培养时间的增长，含油量不断下降。ZL1菌在30h左右去除率达到最大，后含油量下降缓慢，到60h左右曲线趋于平直；ZL2菌在20h左右去除率达最大，48h左右曲线趋于平直。曲线说明ZL1，ZL2菌适应能力较强，ZL1菌在0－60h内生长旺盛对机油的去除率可达67．9％，ZL2菌在0－48h内生长旺盛，对机油的去除率高达76.2％，试验后期降解曲线趋于平直，含油量基本不再变化，可能是由于机油中的一些重组分难于降解的原因。